这些结核疫苗研究套路，你知道吗？
结核病仍然是世界上最致命的传染病之一，其发病率持续增高。如何对结核病进行有效的预防成了现在面临的主要问题。而目前广泛使用的卡介苗仅对结核病提供有限的保护，因此新型的结核疫苗便成为抗结核的有利举措。按照免疫策略将其分为代替卡介苗的初选疫苗，BCG初免后的增强疫苗和治疗性疫苗等，按照种类又可分为DNA疫苗、亚单位疫苗、重组BCG疫苗等。疫苗在进入临床研究阶段之前均先进行动物实验，主要是检测免疫原性、保护效果和治疗效果，动物实验套路如下：
在详细解说套路之前，先了解一下几个概念：
（1）重组BCG疫苗：将特定基因导入现有BCG株，使其表达结核分枝杆菌 MTB重要保护性抗原或其他因子，提高其免疫效应又降低安全隐患。
（2）亚单位疫苗：是由一种或多种被认为具有保护性的抗原构成，与佐剂、减毒病毒载体（腺病毒（aeras-402 / Crucell 35）和牛痘病毒（MVA85A））配伍联用接种后能够诱导高强度表达的保护性免疫应答，既可以用于单独主动免疫，也可以与 BCG疫苗结合免疫预防结核感染。这些亚单位疫苗在BCG疫苗接种后可作为增强剂，目的是改善BCG 诱导的免疫保护，即增加疗效并延长其持续时间。
（3）DNA 疫苗：是将编码目的抗原蛋白基因序列的质粒导入宿主细胞，通过转录系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗。
1、无论是重组BCG疫苗、亚单位疫苗还是DNA 疫苗，都需要先重组构建及鉴定：
以基因H37RV基因组为模板，PCR扩增X基因，插入Y质粒载体中，经酶切鉴定与序列测定证实后，构建重组蛋白疫苗。
2、安全性检测：
急性毒性试验：分别将低剂量与高剂量的重组疫苗经皮下、腹腔两种途径免疫小鼠，观察小鼠毒性反应、死亡情况及体重变化等，同时推算小鼠对 LT70-DPC 亚单位疫苗的最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）；通过对小鼠血清中几种关键物质的分析评价重组疫苗对心脏、肝脏和肾功能的潜在毒性。
3、免疫原性检测：
将构建的疫苗经皮下/腹腔/滴鼻/尾静脉免疫小鼠，同时设置对照组，末次免疫后处死小鼠：
（1）体液免疫：小鼠处死前内眦取血，ELISA检测小鼠血清中特异的抗体总IgG及亚类 IgG1和IgG2c的水平；
（2）细胞因子的分泌：获取脾组织，分离并培养脾淋巴细胞，收集上清，通过ELISA检测Th1细胞因子（IFN-γ、TNF、IL-2）的表达；Th2型细胞分泌的IL-4、IL-5和IL-10细胞因子；
（3）多功能T细胞的诱导:获取脾组织，分离并培养脾淋巴细胞，ICS染色（CD3、CD4、TNF-α、IFN-γ、IL-2），流式细胞仪检测。
4、免疫保护性检测：（先接种疫苗，再用菌株感染，CFU计数必不可少）
CFU计数：将构建的疫苗经皮下/腹腔/滴鼻/尾静脉免疫小鼠，同时设置对照组，然后对免疫n周的小鼠尾静脉/气溶胶感染BCG/H37Rv，感染n周后，处死小鼠，无菌取肺和脾脏，一部分称重制备匀浆液，稀释后涂布于7H11培养皿上，37°C培养一段时间后观察计数；
HE染色：另一部分进行HE染色，进行肺组织病理学检查。
5、治疗效果检测：（先用菌株感染构建感染模型，再接种疫苗免疫，CFU计数必不可少）
CFU计数：先将小鼠通过尾静脉/气溶胶感染H37Rv/BCG，随机分组，末次免疫结束后第n天处死小鼠，无菌取肺、脾组织制成匀浆液，一部分称重制备匀浆液，稀释后涂布于7H11培养皿上，37°C培养一段时间后观察计数；
HE染色：小鼠的肺组织进行HE染色，进行病理学观察。
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1. Formulation in DDA-MPLA-TDB liposome enhances the immunogenicity and Protective effcacy of a DNA Vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection
DMT是由二甲基十二烷基铵(DDA)和两种模式识别受体激动剂单磷酸脂A和海藻糖6,6-二苯酸酯(TDB)组成的新型脂质体佐剂。为阐明DMT的作用机制，提高DNA疫苗诱导的免疫效果，构建了一个新的重组真核表达质粒pCMFO，该质粒可融合4种结核分枝杆菌多阶段抗原（Rv2875、Rv3044、Rv2073c、Rv0577）。然后制备了pCMFO/DDA和pCMFO/DMT配合物，并对它们的理化性质进行了分析。比较疫苗接种小鼠的免疫原性和对结核分枝杆菌感染的保护作用。
结果： pCMFO/DMT是一种非常有前途的结核疫苗，值得进一步的临床前和临床试验。
2. Assessment of recombinant plasmid expressing fusion antigen Ag85B-Rv3425 in management of acute tuberculosis infection in mice
本研究构建了表达融合抗原Ag85B-Rv3425(A3)的慢病毒载体重组质粒，并对其免疫原性和治疗作用进行了评价。结果表明，与A3重组蛋白相比，该质粒能适当表达A3，诱导小鼠产生较高的TNF-α和IL-2，此外，表达A3的重组质粒对小鼠的急性结核病感染具有抵抗力，其特点是肺和脾脏中的细菌负荷减少，以及肺组织中结核病病变减轻。这些结果表明，以表达A3的慢病毒载体为基础的重组质粒是治疗急性结核病感染的一种有效且有前途的药物。
3. Immunogenicity and therapeutic effects of a Mycobacterium tuberculosis rv2190c DNA vaccine in mice
在本研究中，构建MTB rv2190c DNA疫苗，并评价其免疫原性和治疗效果。
方法：
（1）以基因H37RV基因组为模板，PCR扩增 rv2190c 基因，插入 pET30a质粒载体中，经酶切鉴定与序列测定证实后，再与真核表达载体pVAX1连接，构建真核表达质粒。
（2）50只6-8周龄未感染的雌性小鼠随机分为5组，分别为①生理盐水组②pVAX1载体组③微卡菌苗组④ ag85a DNA疫苗组⑤ rv2190c DNA疫苗组，每2周肌肉注射1次，共3次，以研究疫苗的免疫原性。
（3）最后1次免疫后3周杀死小鼠，取脾组织，分离脾细胞，铺24孔板，ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清分泌IFN-γ、IL-4的分泌水平;流式细胞术检测全血单个核细胞内分泌IFN-γ的Th1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比及Th1/Th2细胞比值。
（4）50只6-8周龄的雌性小鼠通过静脉注射MTB H37RV，随机分为5组，即①生理盐水组②pVAX1载体组③微卡菌苗组④ ag85a DNA疫苗组⑤ rv2190c DNA疫苗组，第3次免疫后2周处死小鼠，取肺、脾组织制成匀浆液，稀释后涂布在培养皿上，37°C培养4周，计数。
（5）小鼠的肺组织进行HE染色，进行病理学观察。
结果：非感染小鼠注射rv2190c DNA疫苗或ag85a DNA疫苗后，小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ的分泌量较高，PBMC中Th1细胞和Th1/Th2免疫细胞的百分比都显著增加，表明主要刺激Th1型细胞介导的免疫应答；感染小鼠分为5组，生理盐水（A组）、rv2190c DNA疫苗（B组）、 ag85a DNA 疫苗（C组），与生理盐水组小鼠相比，rv2190c DNA疫苗组和ag85a DNA 疫苗组中小鼠肺的CFU计数分别减少了0.283 log10和 0.533 log 10 ，脾的CFU计数分别减少了0.321 log10和0.425 log10 ，并且也降低了病理损害程度。
结论：该rv2190c DNA疫苗对结核病有治疗作用。
4. Multi-subunit BCG booster vaccine GamTBvac: Assessment of immunogenicity and protective efficacy in murine and guinea pig TB models
本研究描述了一种新的疫苗gamtbvac，由MTB的抗原融合蛋白（Ag85A和–ESAT6-CFP10）通过葡聚糖结构域固定在葡聚糖上，并且与佐剂DEAE-葡聚糖、CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）等相结合。
方法：
（1）以基因H37RV基因组为模板，PCR扩增Ag85A和–ESAT6-CFP10 基因，插入 pET28a质粒载体中，经酶切鉴定与序列测定证实后，构建重组蛋白疫苗。
（2）重组疫苗免疫原性观察
将重组疫苗gamtbvac的不同制剂皮下注射小鼠，同时设置BCG组、gamtbvac疫苗初染和免疫后的加强免疫组、BCG初染gamtbvac疫苗用于免疫后的加强免疫组，每隔3周注射2次，最后一次免疫5周后处死小鼠，应用ELISA技术检测脾细胞刺激后IFN-γ的表达。
（3）重组疫苗免疫保护效果观察
H37Rv感染C57BL/6小鼠的保护效应:C57BL/6小鼠分为4组，BCG组、gamtbvac疫苗初染/加强免疫组、BCG初染/gamtbvac加强免疫组以及PBS组，免疫2周后各组动物用H37Rv尾静脉攻毒，30天后处死小鼠，无菌取脾、肺组织，称重并作细菌定量培养计数。
结果表明，在通过尾静脉、气溶胶注射方式感染H37Rv的小鼠模型中，gamtbvac具有很强的免疫原性和免疫保护效果，作为BCG的加强疫苗，gamtbvac表现出较强的保护作用。
5. Conjugation Reaction with 8arm PEG Markedly Improves the Immunogenicity of Mycobacterium Tuberculosis CFP10-TB10.4 Fusion Protein
CFP10和TB10.4是MTB的两个免疫原性较差的分泌性抗原。因此，需要抗原传递系统和佐剂来提高这2种抗原的免疫原性。在本次实验中，将CFP10和TB10.4制成融合蛋白，即CFP10-TB10.4 (CT)，将4-6个CT分子与八臂PEG共轭结合形成抗原传递系统，A-L和poly(I:C) 作为佐剂。
方法：①经过阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化，获得产率较高的修饰产物；对修饰产物进行体外稳定性分析
②体液免疫：ELISA检测CT特异性和CT-PEG特异性抗体滴度试验
③细胞因子的分泌：用ELISA检测 Th1型细胞分泌的IFN-γ、TNF -α和IL - 2细胞因子；Th2型细胞分泌的IL-4、IL-5和IL-10细胞因子
④用FACS测定CD4+ IFN-γ+、CD4+ IL-4+细胞的比例
⑤毒理研究：通过对小鼠血清中几种关键物质的分析评价CT样本对心脏、肝脏和肾功能的潜在毒性。
结果：在BALB/c小鼠 中，与CT相比，CT-PEG引起较高的CT特异性IgG抗体滴度，Th1和Th2型细胞因子以及CD4+ IFN-γ+、CD4+ IL-4+细胞的比例也增加了。A-L和poly(I:C) 作为佐剂都能提高 CT-PEG的免疫原性。CT-PEG 和A-L配对免疫小鼠，没有在器官中检测到毒性；CT-PEG 和 poly(I:C) 配对，显示出一定的毒性。因此，MTB分泌抗原CT共轭结合八臂PEG，再配上佐剂A-L，可形成高效、安全的抗结核疫苗。
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备注：入群学习
从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：
1 | miRNA非经典机制 | 11 | 肠道菌群 |
2 | lncRNA的10种机制 | 12 | 细胞自噬 |
3 | circRNA | 13 | 细胞焦亡、铁死亡 |
4 | 单细胞测序 | 14 | 间充质干细胞 |
5 | 转录因子 | 15 | 肿瘤干细胞 |
6 | 可变剪接 | 16 | 外泌体 |
7 | SNP | 17 | 氧化应激 |
8 | 泛素化修饰 | 18 | 调节性T细胞 |
9 | 组蛋白修饰 | 19 | RNA甲基化修饰 |
10 | 蛋白激酶和磷酸酶 | 20 | 肿瘤微环境 |
而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：
①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；
②分子拷贝数的表达变化差异；
③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；
④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；
⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；
⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；
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